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蛋白質的定量測定方法:微量凱氏定氮法
點擊次數:71 發布時間:2021-01-21

蛋白質的定量測定方法:微量凱氏定氮法

【實驗目的】
  學習凱氏定氮法的原理和操作技術。
  微量凱氏定氮法【實驗原理】
  凱氏定氮法用於測定有機物的含氮量,若蛋白質的含氮量已知時,則可用此法測定樣品中蛋白質的含量。
  當蛋白質與濃硫酸共熱時,其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水,而氮則轉變成氨,並進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消化”。但是,這個反應進行得比較緩慢,通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應液的沸點,並加入硫酸銅作為催化劑,以促進反應的進行。
  消化完成後,在凱氏定氮儀中加入濃堿,可使消化液中的硫酸銨分解,遊離出氨,借助水蒸汽蒸餾法,將產生的氨蒸餾到量、濃度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨後,氨與溶液中氫離子結合,使溶液中的氫離子濃度降低,指示劑顏色改變,然後用標準無機鹽酸滴定,直至恢複溶液中原來的氫離子濃度為止。根據所用標準鹽酸的量可計算出待測物中的總氮量。
  蛋白質的含氮量為16%,即1克蛋白質中的氮相當於6.25克蛋白質,用凱氏定氮法測出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質的含量。
  微量凱氏定氮法【實驗材料】
  1.實驗器材
  微量凱氏定氮儀1套;50ml凱氏燒瓶4個;移液管;錐形瓶;試管;小玻璃珠
  2.試驗試劑
  (1)濃硫酸;30%氫氧化鈉溶液;2%硼酸溶液;標準鹽酸溶液(0.01mol/L)。
  (2)粉末硫酸鉀—硫酸銅混合物:K2SO4與CuSO4·5H2O以3:1配比研磨混合。
  (3)混合指示劑(田氏指示劑):由50ml0.1%甲烯藍乙醇溶液與200ml0.1%甲基紅乙醇溶液混合配成,貯於棕色瓶中備用。
  (4)樣品溶液:配製3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。
  【實驗操作】
  1.安裝凱氏定氮儀。
  2.消化:取4個50ml凱氏燒瓶並標號,各加1顆玻璃珠,在1號及2號瓶中各加樣品1ml,催化劑(K2SO4-CuSO4·5H2O)200mg,濃硫酸5ml。注意加樣品時應直接送入瓶底,而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號及4號瓶中各加1ml蒸餾水和與1、2號瓶相同量的催化劑和濃硫酸,作為對照。在通風櫥內進行消化。
  在消化開始時應控製火力,不要使液體衝到瓶頸。待硫酸開始分解並放出SO2白煙後,適當加強火力,繼續消化,直至消化液呈透明淡綠色為止。撤掉火力,冷卻至室溫。 

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